· polyakrylamidGél musí byť vytvorený akrylamidovým monomérom, východiskovým materiálom pre polymerizáciu, katalyzátorom a správnou zmesou soli a pufra.
· akrylamida BIS (N,N'-metylénový dvojitý akrylamid) je monomér vo forme gélovej matrice.
· persíran amónny spúšťa proces polymerizácie lepidla. Na prípravu lepidla je potrebný 10 % roztok persíranu amónneho pripravený vo vode. Väčšina informácií uvádzala potrebu aktívneho použitia. 10 % roztok sa však môže uchovávať pri teplote 4 °C niekoľko týždňov bez výraznej straty aktivity. Doplňte do 10 ml a zlikvidujte, keď lepidlo prestane stuhnúť.
Tip: PercentoakrylamidPri sekvenovaní nie je lepidlo a proteínové lepidlo to isté. Ak používate vopred pripravený roztok akrylamidu:BIS, uistite sa, že máte správnu fľašu.
· TEMED (N, N, N ', N '- tetrametyletyléndiamín) je katalyzátor v hnedej fľaši umiestnenej v chladničke. Pridajte tesne pred naliatím lepidla.
· polyakrylamidová elektroforéza: sklo použité pri elektroforéze by sa malo umyť pred a po každej elektroforéze. Po elektroforéze umyte mäkkou kefkou a handričkou v horúcej mydlovej vode, opláchnite destilovanou vodou a nechajte uschnúť.
· vlhkosť a prach môžu spôsobiť podráždenie dutého polyméru. Pred elektroforézou očistite sklenenú platňu čistiacim prostriedkom na sklo a utrite ju mäkkou kefkou. Umyte destilovanou vodou a dôkladne osušte papierovou utierkou. Opláchnutie 70 % etanolom pred utretím papierom pomáha vyčistiť a urýchliť sušenie. Postupne pridávajte vzorky akrylamidu: BIS, vodu, tlmivý roztok, persíran amónny, TEMED. Dobre pretrepte a ihneď nalejte.
Pred polymerizáciou nie je potrebné polyakrylamid odplyňovať. (Akrylamid sa predtým umiestňoval do vákua, aby sa odstránili bubliny, pretože kyslík inhibuje polymerizáciu.)
Vzorky hrotov pre horizontálne lepiace body.
· Vložte do spodnej krabice kus čierneho papiera s čiernym pozadím, aby ste vytvorili otvor na vzorku a lepšie videli.
· pufor naplnený nádržou na lepidlo, tesne nad koloidom.
· ak je na okraji svetlo, zapnite ho a nechajte koloid svietiť. Natiahnite vzorku do pipety.
· pomocou automatického pipetovacieho zariadenia.
· pri 10 – 200 μm je možné vo väčšine bodov vzorky použiť 1 bod s pohyblivou kvapalinou. Pre veľmi malé otvory vzorky (menej ako 10 μ1) je pohodlnejšia dlhá pipetová hlavica používaná na sekvenovanie lepidla.
· pipetovanie iba ponorené do vzorky, vdychovanie pomaly sa pohybujúcej tekutiny. Vzorka sa môže zdať lepkavá od glycerínu a rýchle pumpovanie môže vtiahnuť vzduchové bubliny do hlavy pipety.
· Po vdýchnutí vzoriek pipetovacou hlavicou jemne posuňte hlavicu s tekutinou po okraji trubice alebo utierkou papiera, aby ste vysali hlavicu s tekutinou mimo kvapôčok. Dávajte pozor, aby ste vzorku nevysali.
Vložte vzorku do otvoru na vzorku
· pipetovacie zariadenie na udržanie mierneho tlaku, aby vzorky mierne pohli pretečenou kvapalinovou hlavicou.
· Pipetovacia hlavica zasunutá do pufra, mierne vyššie ako bodové otvory, udržiava pozitívny tlak. Špičku pipety je možné zasunúť do malého otvoru.
· pomaly a rovnomerne vyberajte vzorky. Hrot pipety sa umiestni nad otvor pre vzorku a vzorka sa do otvoru ponorí. Nechajte vzorku ponoriť sa, aby sa otvor zaplnil, namiesto toho, aby ste ju zatlačili dovnútra.
· akonáhle posledná kvapka vzorky klesne na kvapalinovú hlavu, kvapalina sa presunie do druhej vetky, pomaly sa zdvihne a vyjde z tlmivého roztoku
Ako urobiť vertikálny odber vzoriek lepidla?
· vertikálne lepené body, otvory pre vzorky vytvorené medzi dvoma kusmi skla. Pri veľmi riedkom lepidle sa hlavica pipety nedá ani zasunúť medzi dve sklenené platne. Pozor na glycerín! Umiestnite hlavicu pipety nad otvor pre vzorku a vzorka sa do otvoru ponorí.
· Pred odberom vzorky sa uistite, že vertikálny bod polypropylénového acylgélu vo vzorkovom otvore je opláchnutý dočista. Umyte nespolymerizovaný akrylamid a vodu, ktorá sa môže objaviť na dne vzorkového otvoru. Voda môže výrazne zmenšiť vzorkový otvor. Použite 25 ml alebo 50 ml injekčnú striekačku a ihlu kalibru 18. Nalejte elektroforetický pufor a opatrne prepláchnite vzorkový otvor.
· Môže byť ťažké vidieť otvor pre vzorku, ale zároveň je zvyšok jednoduchý. Ak sú otvory nadbytočné, vzorkový pufor sa môže otestovať brómfenolovou modrou.
Čas uverejnenia: 31. marca 2023